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      感覺態細胞的制備和轉化注意事項

      點擊次數:37次  發布時間:2022-08-03
         感覺態細胞的制備:
        注①:有化轉和電轉兩種。
        注②:制備具體步驟因人而異。
        將處于對數生長期的大腸桿菌(細胞的感受態一般出現在對數生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感覺態細胞和進行成功轉化的關鍵。對數生長前期的細菌可通過測定培養液的OD600控制,所以要嚴密監測細菌的OD值)置于經低溫預處理的低滲CaCl2溶液(CaCl2和水需是較高純度的)中,在低滲CaCl2溶液中,細胞會膨脹,同時Ca2+還會使磷脂雙分子層形成液晶結構,促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區域,細胞膜通透性發生變化,極易與外源DNA相粘附并在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物。(整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿高壓滅菌處理)添加其它的二價金屬離子、DMSO或還原劑等物質處理,提高轉化率。
       
        感覺態細胞的轉化注意事項:
        連接反應產物在轉化之前在70ºC熱滅活15min,連接產物在熱滅活后無需純化可直接使用;
       
        DNA樣本必須是溶解于ddH2O或TEbuffer的純化樣本。電轉化樣本中如果存在鹽離子會導致電轉過程中的高壓電弧,從而引起細胞和DNA的損失;
       
        微量離心管和電轉杯在使用前必須冰??;
       
        在使用之前必須在冰上解凍;
       
        為了得到高效的轉化效率,請使用試劑盒中的重懸電轉后的細胞,如果使用TB或其它培養基會降低感受態的轉化效率;
       
        電轉后的細胞可以在LB或其它常規培養基上涂板。
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